微生物实验步骤怎么写

1、准备工作，培养基的配制及灭菌（121-126度灭30分钟高压蒸汽式灭菌），玻璃器皿的灭菌（170度灭2小时干热灭菌，也可用湿热灭菌）若量大可加长灭菌时间。

2、微生物实验室及无菌操作台开紫外灯灭菌1小时，关闭后至少半小时才进入无菌室，我们一般1小时后才进去。因为紫外灯照射后有残留。

3、进入无菌室要穿戴专门的衣服，帽子，鞋子，口罩，手套。在接触无菌的东西都要用75%的酒精喷洒或涂抹，如果是药品就要求更严。

4、实验完后，把平皿倒置放入设定好温度的培养箱内，并在要的时间观察记录。

5、完后无菌室可以打开通风，不然里面的酒精味很难闻！

6、实验没有用完的样品扔了就行了！不过观察后有长菌的培养基最好烧开在倒，平皿最好煮一下。

参考资料来源：百度百科-微生物实验室

热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到 60 ℃以下 再开盖取物，以防突然减压液 体剧烈沸腾或容器爆破。

（3） 卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行： ① 关紧锅门，打开进气阀，将蒸气引入夹层进行预热，夹层内冷空气经阻气器自动 排出。 ② 夹层达到预定温度后，打开锅室进气阀，将蒸气引入锅室，锅室内冷空气经锅室 阻气器自动排出。

③ 待锅室达到规定的压力与温度时，调节进气阀，使保持恒定至 ④ 自然或人工降温至 60 ℃再开门取物，不得使用快速排出蒸气法，以防突然降压， 液体剧烈沸腾或容器爆破。 ⑤ 使用自动程序控制式压力蒸气灭菌器，在放好物品关紧门后，应根据物品类别按 动相应开关， 以便按要求程序自动进行灭菌， 灭菌时必须利用附设仪表记录温度与时间以 备查，操作要求应严格按照厂家说明书进行。

5 .灭菌温度与时间 （1） 干热灭菌器灭菌温度 160 ℃， 1.5-2h 。 (2) 压力蒸气灭菌 锅灭菌温度与时间 （二）间歇灭菌方法 1. 灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌，某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏，可用此 法灭菌。

（ 1 ）将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。 （ 2 ）关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒 10 ~ 20min 。

( 3 )灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温温度，放入 37 ℃温箱过夜，次日仍 按上述方法消毒，如此三次，即可达到灭菌目的。 2 .血清凝固器使用方法，培养基中含有血清或鸡蛋特殊成份时，因高热会破坏其营 养成份，故用低温，可使血清凝固，又可达到灭菌目的。

（1） 在使用该法灭菌的血清等分装时，需严格遵守无菌操作，试管、平皿也经灭菌后 使用。 （2） 将培养基按要求使成斜面或高层， 加足水后， 接上电源， 升温 75 ~ 90 ℃ 1h 灭菌， 放 37 ℃温箱过夜，再如此灭菌三次。

3 .煮沸消毒：可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮 5 ~ 15 min ，也可在水中加入 2 ﹪石炭酸煮沸 5 min ，加入 0.02 ﹪甲醛 ， 80 ℃煮 60 min 均可达到灭菌目的 ， 但选用 煮沸消毒的增消剂时 ， 应注意对物品的腐蚀性 . 4 .灭菌处理 ： 灭菌后物品 ， 按正常情况已属无菌 ， 从灭菌器中取出应仔细检查放置 ， 以免 再度污染。 （1） 物品取出 ， 随即检查包装的完整性 ， 若有破坏或棉塞脱掉 ， 不可作为无菌物品使用。

（2） 取出的物品 ， 如为包装有明显的水浸者 ， 不可作为无菌物品使用。 （3） 培养基或试剂等 ， 应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态 ， 未达到者应废弃。

（4） 启闭式容器 ， 在取出时应将筛孔关闭。 （5） 取出的物品掉落在地或误放不洁这处 ， 或沾有水液 ， 均视为受到污染 ， 不可作为无 菌物品使用。

（6） 取出的合格灭菌物品 ， 应存放于贮藏室或防尘柜内 ， 严禁与未灭菌物品混放。 （7） 凡属合格物品 ， 应标有灭菌日期及有效期限。

（8） 每批灭菌处理完成后 ， 记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。 四、有毒有菌污物处理要求 微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。

1. 经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地 点，待统一进行高压灭菌。 2. 经微生物污染的培养物，必须经 121 ℃ 30min 高压灭菌。

3. 染菌后的吸管，使用后放入 5 ﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡 24h （消毒 液体不得低于浸泡的高度）再经 121 ℃ 30 min 高压灭菌。 4. 涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯 中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入 5 ﹪煤酚皂溶液中浸泡 24 h 后，煮 沸洗涤。

做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。 5. 打碎的培养物， 立即用 5 ﹪煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位， 浸泡半 小时后再擦拭干净。

污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经 高压灭菌后方能洗涤。 五、培养基制备要求 培养基制备的质量将直接影响微生物生长。

因为各种微生物对其营养要求不完全相同， 培养目的的不同，各种培养基制备要求如下： 1 .根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药 品应进行质量检验。 2 . PH 测定及调节： PH 测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下， 其 PH 有一定差异，当测定好时，按计算量加入碱或酸混匀后，应再测试一次。

培养基 PH 值一定要准确， 否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。 但需注意因高压灭菌可 影响一些培养基的 PH 降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基 的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完 PH 后再加入。

3 .培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脱脂棉 花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净晾干 后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度。 4 .盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。

5 .培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养。

大多数细菌可在蛋白胨牛肉膏培养中生长，就是蛋白胨牛肉膏培养基为例实验步骤如下：

1、培养皿用报纸包起来，灭菌

2、配制培养基，培养基完全溶于水后，调PH值7.2-7.4之间。

3、配制好并调完PH值的培养基中，按1.5%的比例加入琼脂粉。（教材上写要加热溶解后再灭菌，根据工作经验，加入培养基中，直接灭菌，高温状态下，琼脂自然就溶解了）

4、灭菌后的培养基倒入平板中，琼脂凝固后，倒置。

5、接种环在酒精灯的火焰上烧红后，降温，取一环菌，在平板上划线。

6、划线后的平板，倒置放入培养箱中培养。

7、培养24小时后，观察菌苔形态、菌生长情况。

以上是我工作的步骤，可能与书上有出入，因工作时间长了，有些细节就不太注意了。还是要以微生物实验书以主。

标本制作：

制作显微镜标本，分一下6大步骤，可以供初学者进行参考：

1.取载玻片与盖玻片各一片，用软布擦干净，由于盖拨片很薄，擦时要小心，可用左手拇指和食指夹住盖玻片边缘，把纱布平铺在右手手掌上，从上下两面轻轻夹住盖玻片，平均使用力量慢慢轻擦，这样才不会把盖玻片擦碎。

2.用滴管吸取1~2滴清水，放在载玻片中央。

3.用镊子撕取观察物体一小片（无论观察细胞组织或器官，材料必须做成薄片，才能观察，这些薄片不能过厚，一般一层细胞的厚度为好，如果过厚不但细胞互相重叠，而且光线不易穿透，虽然在显微镜下能勉强看到轮廓，但细致的结构很难看清），置于载玻片上的小水滴中，尽量勿使材料皱缩。

4.用镊子夹取一片干净的盖玻片，先以盖玻片的一边斜着与小水滴接触，然后便慢慢放下盖玻片，将观察材料全部盖上，操作时，防止盖玻片骤然下降，以免发生气泡，妨碍观察效果。

5.制作好的玻片，要求盖玻片与载玻片之间恰好被水分充满；当水分不足时，可用滴管从盖玻片一侧的边缘滴少许水分，在另一侧用吸水纸吸，从而使盖玻片与载玻片之间被水分充满；当水分多余时，可用吸水纸吸去多余水分。

6、染色：用滴管从盖玻片一侧的边缘滴少许碘液，在另一侧用吸水纸吸，从而使盖玻片与载玻片之间被碘液充满；当碘液多余时，可用吸水纸吸去多余碘液。 制作好后就可以放到显微镜下面观察了。

一、目的要求

学习平板菌落计数的基本原理和方法。

二、基本原理

平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。

这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。

三、器材

大肠杆菌悬液，牛肉膏蛋白胨培养基， 1ml无菌吸管，无菌平皿，盛有4. 5 ml无菌水的试管，试管架和记号笔等。

四、操作步骤

1.编号：

取无菌平皿 9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有4.5ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

2.稀释

用1ml无菌吸管精确地吸取0.5ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出时，管内液体外溢。然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸0.5ml放入10-2试管中，吸吹三次，……其余依次类推。整个稀释过程如图Ⅷ-3。

3.取样

用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0.2ml，对号放入编好号的无菌培养皿中。

4.倒平板

于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于37℃温室中培养。

5.计数

培养24小时后，取出培养皿，算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：

每毫升中总活菌数=同一稀释度三次重复的菌落平均数*稀释倍数*5

一般选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为合适。同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬殊，如相差较大，表示试验不精确。

平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。

平板菌蓓计数法的操作除上述的以外，还可用涂布平板的方法进行。二者操作基本相同，所不同的是涂布平板法是先将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，待凝固后编号，并于 37℃温室中烘烤30分钟左右，使其干燥，然后用无菌吸管吸取 0.2ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培养皿中的培养基上，再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20—30分钟，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于37℃的温室中培养。

五、实验报告

1.结果

将计数结果填入下表。

2.思考题

(1)为什么溶化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？

(2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？

(3)同一种菌液用血球计数板和平板菌落计数法同时计数，所得结果是否一样？为什么？

(4)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点。

一片白？全是菌落吗？如果是的话就是你涂平板时用的菌液太浓导致菌落和菌落之间无法分开，连成一片。另外，涂布时用的涂布棒或是接种环在灼烧后应接触培养皿上盖内侧一会儿，在降温后在去接触菌液，不然容易烫死细菌。

服了你，我敢肯定你取样后肯定就直接将样品全倒到培养基上了，这是不正确的，样品必须进过稀释，否则菌落密度很高，连成一片。

1.首先，你得根据你所要的细菌设计一培养基，尽可能使得只有你要的这一细菌能在培养基上生存，如果不考虑细菌的种类，只考虑他们的数量的话，则可以用全营养培养基。

2.然后算样品液的总体积，从中取1ml出来放进一灭菌试管中，加液体培养基9ml，摇匀，此时菌液被稀释10倍。再从这一试管中取1ml液体加入另一无菌试管中，在往这新的试管中加入液体培养基9ml，此时新试管中的菌液被稀释了100倍，重复，下去，直到被稀释100000倍后为止。

3.接着将上述试管中的菌液各取1ml注入到固体培养基上（此时又相当于在各试管稀释的基础上又稀释了10倍），用灭菌涂布棒涂布均匀，进行培养。

最后，找出菌落分散较好的培养基，计数菌落，然后乘以稀释倍数（要包括步骤3中的那10倍）再乘以你得样品的总体积数，从而得出细菌总数。

注意：以上操作必须在无菌条件下进行。

实验原理： 从复杂的微生物群体中获得只含有一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的方法有1、简单单细胞挑取法 2、平板分离法此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化。其原理包括两方面：1、在适合于待分离微生物的生长条件（如营养、酸碱度、温度与氧等）下培养微生物，或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

2、微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得纯培养。

获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等方法完成。 但是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。

因此，纯培养的确定除观察其菌落的特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。有的微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化的到许多有价值的菌株。

此实验将从土壤中分离两种细菌。实验器材、试剂与菌种：1、器材：培养皿、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、电炉、玻璃棒、接种环、镊子、搪瓷杯、恒温培养箱、高温灭菌锅、移液枪（枪头）、电子天平、滤纸、pH试纸等。

2、试剂：配制牛肉膏蛋白胨培养基的原料（牛肉膏、NaCl、琼脂、蛋白胨）、配置糖发酵培养基的原料（葡萄糖、K2HPO3、溴百里酚蓝、琼脂、NaCl、蛋白胨）、甘油（丙三醇）、结晶紫染液、番红染液、碘液、95%乙醇、5%孔雀绿染液、0.5%番红水染液、3%过氧化氢水溶液、1%盐酸二甲基对苯撑二胺溶液、蒸馏水等。3、土样：取自山东大学7号宿舍楼门前土壤，地下10cm左右。

实验步骤：1、配制牛肉膏蛋白胨培养基：1）配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基500ml （用于12个平皿和10支试管斜面） 牛肉膏 0.3% ………………………………… 1.5 g 蛋白胨 1% …………………………………… 5g NaCl 0.5% ………………………………… 2.5g 琼脂 2% …………………………………… 10g pH ………………………………………… 7.0~7.2 2）倒12个平板和10支试管斜面，包扎，121℃灭菌20min.2、制备土壤稀释液：称取土样10g，放入盛有100ml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇匀10min 使土和水充分混合，然后用移液枪从三角瓶中吸取1ml（此操作要求无菌操作），加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推分别制成制成0.01、0.001、0.0001不同稀释度的土壤溶液。3、涂布培养：以0.01以及0.0001两个浓度的土壤稀释液作为涂布平板培养的对象，将其分别涂布在3个牛肉膏蛋白胨培养基中，共6个培养基，标号，37°C温箱培养48 h。

4、划线分离（划线培养）：对两种土壤溶液的微生物培养基进行观察，记录两种区分明显的细菌性状。挑取此两种细菌在新的培养基中划线培养（每种细菌培养3个培养皿），标号、37°C培养。

5、初步鉴定：对两种菌进行简单染色、革兰氏染色以及芽孢染色观察，记录结果。6、试管斜面再培养： 将两种纯菌株接种分别接种在5支试管中，共10支试管。

37°C培养（18-24h）。7、对试管中培养的两种菌进行生理生化鉴定： 1）过氧化氢酶鉴定： A 实验原理：乳酸菌与许多厌氧菌与其他细菌区分的主要依据是鉴定有无过氧化氢酶。

该酶可以把过氧化氢分解为水与氧气，气体氧以气泡跑出来，则为过氧化氢酶实验阳性。乳酸菌和许多厌氧菌在过氧化氢酶实验中呈现阴性。

B 步骤：将培养新鲜的待测菌种（培养18-24h内）接在载玻片上，滴一滴3%过氧化氢于菌体上。 2）糖发酵与氧化实验 A 实验原理：在细菌的分类鉴定中，糖发酵与氧化测定是一项重要的依据。

绝大多数细菌都可以利用糖类作为能源以及碳源，但由于不同的菌存在酶系的差异，因而对糖类的发酵与氧化的能力就有所不同。有的在糖类发酵与氧化代谢中能分解糖类，产酸产气，有的则只能产酸不可以产气。

酸的产生与否，以及是发酵型产酸还是氧化型产酸，可以由预先加在培养基中的指示剂（溴百里酚蓝水溶液）呈现出来。这样把接好菌种的培养基放在厌氧或好氧的环境下培养，培养基有绿色变为黄色为产酸，是否产气是通过观察培养基中是否产生气泡或培养基断裂来测定。

B 步骤 ① 配置糖发酵培养基150 ml （葡萄糖：、K2HPO3：、溴百里酚蓝、琼脂：、NaCl：、蛋白胨：），分装试管。 ② 110°C灭菌培养基20 mins （同时灭菌一定量甘油，待用）。

③ 对两种细菌进行“穿刺”培养，每种菌做5个试管：2个盖管培养，2个开管培养，一个为盖管对照组。在培养基的上方加入1-2cm厚的甘油，作为“盖 管”，以提供菌体无氧的生长环境，开管则不加甘油，作为有氧的生长环境供菌体生长。

④ 在37°C下培养，并在培养24h后观察培养基中颜色的变化，以及有无气泡。 3）细胞色素氧化酶测定 A 实验原理 细胞色素氧化。